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Recherche de Légionelles par PCR
Caractères bactériens
La mise en évidence des bactéries peut reposer sur deux types de caractères
- Le phénotype :
- ensemble de caractères observables, influencés par l’environnement de la bactérie
- objectivés par la culture, l’isolement, la morphologie, les tests biochimiques et immunologiques …
- Le génotype :
- ensemble des constituants génétiques, exprimés ou non, déterminant partiellement le phénotype
- portés par l’ADN et les gènes
Méthode phénotypique
La mise en culture
- Filtration sur membrane, concentration
- Ensemencement de milieux
- Incubation et multiplication
Lecture et sélection des colonies
Étapes d’identification
- Repiquage sur milieux différentiels
- Tests immunologiques
Méthode génotypique : la PCR
Filtration, concentration
Extraction et purification de l’ADN
Amplification de la séquence cible de l’ADN
- Spécifique du genre Legionella spp
- Spécifique de l’espèce Legionella pneumophila
Quantification des séquences amplifiées
Durée totale de 8 à 48h
Bases théoriques
Reproduire la réplication naturelle de l’ADN
- En ciblant une zone
- En fournissant les amorces, les enzymes et les oligonucléotides nécessaires
- En répétant le cycle entre 30 et 50 fois
PCR quantitative en temps réel (qRT -PCR)
Utilisation d’un indicateur fluorescent de la production des amplicons durant chaque cycle
L’augmentation du signal est proportionnelle à la quantité des produits de PCR
Caractéristiques des deux méthodes
| Culture | qRT -PCR |
| Multiplication des bactéries viables et cultivables | Amplification de l’ADN des bactéries viables cultivables ou non et des mortes intègres |
| Numération en UFC/l | Quantification en UG/l Plus souvent positive Signal > culture Mal corrélée à la culture |
| Limite détection 50 UFC/l Limite quantification 250 UFC/l |
Limite détection 30 à 200 UG/l Limite quantification 100 à 500 UG/l |
| Faux négatifs possibles Du fait de la technique : - sélectivité des milieux et des traitements - absence de test d’identification de toutes les espèces Du fait de l’échantillon : - présence de flore interférente - perte de cultivabilité des souches (stress) |
Faux négatifs rares Du fait de la technique : - défaut d’extraction, - défaut de purification Du fait de l’échantillon : - présence d’inhibiteurs Éliminés par contrôles internes Grande fiabilité des résultats négatifs |
| Détecte l’ensemble des espèces de Legionella | |
| Bonne prédictivité du risque sanitaire | Prédictivité du risque sanitaire inconnue |
| Niveaux d’alerte et réglementaires établis par cette méthode Plus représentative du caractère infectieux des souches ? |
Aucun niveau de risque établi par cette méthode Rend compte des BVNC qui peuvent conserver leur caractère infectieux ? |
| Isolement de la souche pour enquête épidémiologique Sérotypage possible de L. pneumophila |
Constitue donc un complément de la méthode par culture Contrôle sanitaire |
Application au LHE
Analyse d’échantillons d’eau mise en oeuvre
- depuis plus de 5 ans par PCR traditionnelle
- en qRT-PCR depuis 2 ans
Utilisée à visée de recherche car méthode non « officielle » pour la surveillance des eaux (note DGS du 3 mars 2005)
Demandes ponctuelles des DDASS ou de certains établissements à visée prédictive d’un risque pour des installations
En revanche, grande utilité pour l’identification sans ambiguïté des souches de Legionella non pneumophila isolées par culture
- N’agglutinant pas avec les tests disponibles mais possédant les caractères de Legionella
- Confirmation du genre en 4h
- Envoi au CNR pour confirmation du genre et identification de l’espèce si nécessaire : 1/50 résultat non concordant avec le CNR avec une souche issue d’une eau minérale sulfurée
- De même, identification des souches de Staphylococcus aureus isolées par culture
Conclusion
La qRT-PCR est une méthode aujourd’hui fiable et validée grâce aux travaux de la normalisation
Facile à mettre en oeuvre du fait de l’existence de kits commerciaux performants et validés
Complément utile des techniques traditionnelles par sa très grande spécificité
Outil d’avenir qui a déjà modifié les pratiques des laboratoires